人骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法 產(chǎn)品編號(hào)：TBD2013CHU 產(chǎn)品名稱：人骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離液試劑盒 技術(shù)文檔編號(hào)：TBD0024SOP 【產(chǎn)品規(guī)格】 200ml/Kit 【產(chǎn)品組成】 為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下： 名稱 產(chǎn)品編號(hào) 規(guī)格 A XXXX 動(dòng)物骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離液 200ml B 樣本稀釋液（贈(zèng)品） 2010C1119 200ml C 清洗液（贈(zèng)品） 2010X1118 200ml D F 液（贈(zèng)品） F2013TBD 200ml E 說明書 1 份 【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】 適用儀器：最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī) 【檢驗(yàn)方法】 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。 1.首先制備骨髓單細(xì)胞懸液，制備方法詳見“骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)”。 2.取一支 15ml 離心管，加入與骨髓單細(xì)胞懸液等量的分離液（注：分離液最少不得少于 3ml）。 3.用吸管小心吸取骨髓單細(xì)胞懸液加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min。（注：根據(jù)骨髓單細(xì)胞懸液量確定離心條件，骨髓單細(xì)胞懸液量越大，離心力越大，離心時(shí)間越長(zhǎng)，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到最佳分離效果）。 4.離心后，此時(shí)離心管中由上至下分為四層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。 5.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色單個(gè)核細(xì)胞層到另一 15ml 離心管中，向離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118），混勻細(xì)胞。 6.250g，離心 10min。 7.棄上清。 8.用吸管以 5ml 清洗液（產(chǎn)品編號(hào)：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。 9.250g，離心 10min。 10.重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。 分離圖例 【注意事項(xiàng)】 1.全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣品存放時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。 2.本實(shí)驗(yàn)最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無(wú)靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會(huì)變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。 3.吸取過多的單個(gè)核細(xì)胞層及分離液層會(huì)導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒細(xì)胞數(shù)量增加。 4.分離液用量大于骨髓單細(xì)胞懸液樣本時(shí)，分離效果更佳。 5.如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請(qǐng)聯(lián)技術(shù)支持以尋求幫助. 【儲(chǔ)存條件及有效期】 常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無(wú)菌條件操作。無(wú)菌條件下操作，啟封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。 【參考值（參考范圍）】 本實(shí)驗(yàn)單個(gè)核細(xì)胞提取率及純度大于 80%。 下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。 紅細(xì)胞 白細(xì)胞 血小板 （4.0-10.0）×109 含量（個(gè)/L） （4.0-5.5）×1012 中性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 單核細(xì)胞 （1.0-3.0）×1011 50%-70% 20%-40% 3%-8% 【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】 1.骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。 2.所獲得單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。 3.所獲得單個(gè)核細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。 4.所獲得單個(gè)核細(xì)胞的鑒定方法A.流式細(xì)胞技術(shù)B.免疫組化技術(shù)C.原位雜交技術(shù) D.PCR 技術(shù) 【可能存在的問題及解決方法】 1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示： 出現(xiàn)情況 出現(xiàn)原因 建議解決方案 離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層 轉(zhuǎn)速過小或離心時(shí)間過短 適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速 離心后目的細(xì)胞存在于分離液中 轉(zhuǎn)速過大或離心時(shí)間過長(zhǎng) 離心后白環(huán)層彌散 細(xì)胞密度過大 調(diào)整細(xì)胞密度 離心后白環(huán)層太淺或看不見 細(xì)胞密度過小 2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對(duì)離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，恒定離心時(shí)間，對(duì)離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。 3.本分離液依照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級(jí)原料，性能指標(biāo)與國(guó)產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可 能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。 注：在對(duì)離心條件進(jìn)行調(diào)整時(shí)，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果，離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時(shí)間以 20-30min 為準(zhǔn)。