產(chǎn)品編號：TBD2013DG
 
產(chǎn)品名稱：鵝骨髓單核細(xì)胞分離液試劑盒
 
產(chǎn)品規(guī)格：2X200ml/Kit
 
產(chǎn)品價格：￥800.00元
本品用于分離鵝骨髓單核細(xì)胞

 
 
“XXXX”動物骨髓單核細(xì)胞分離液實(shí)驗(yàn)方法
 
技術(shù)文檔編號：TBD0028SOP
 
【產(chǎn)品規(guī)格】
 
2×200ml/Kit
 
【產(chǎn)品組成】
 
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
 

	名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格
A	分離液 1		200ml
B	分離液 2		200ml
C	樣本稀釋液（贈品）	2010C1119	200ml
D	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
E	F 液（贈品）	F2013TBD	200ml
Ｆ	說明書		1 份

 
【實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備】
 
適用儀器：最大離心力可達(dá) 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
 
【檢驗(yàn)方法】
 
全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。
 

• 首先制備骨髓單細(xì)胞懸液，制備方法詳見“骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)（文檔編號：

 
TBD0004SOP）”。
 

• 取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細(xì)胞懸液體積比為 2：1。如細(xì)胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

 

• 用吸管小心吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上，400-500g，離心 20-30min（注：根據(jù)血液樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達(dá)到最佳分離效果）。

 

• 離心后，此時離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細(xì)胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細(xì)胞層。第六層為紅細(xì)胞層。

 

• 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細(xì)胞。

 

• 250g，離心 10min。

 

• 棄上清。

 

• 用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細(xì)胞。

 

• 250g，離心 10min。

 

• 重復(fù) 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實(shí)驗(yàn)所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。

 
分離圖例
 
 
 
【差異貼壁法純化細(xì)胞】
 
（1）用單核細(xì)胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：CTBD2011）或單核細(xì)胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)品
 
編號：HCTBD2011）以 1.5-3×10⁶ 個/ml 的密度重懸細(xì)胞，將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或
 
細(xì)胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
 
（2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體（俗稱為單核細(xì)胞）。
 
（3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
 
（4）不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
 
注：
 

• 無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8%經(jīng)灝洋篩選的胎牛血清。

 

• 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定）。

 

• 由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的，此法成

本相對較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰
 
性分選。
 
【注意事項(xiàng)】
 

• 全過程樣本、試劑及實(shí)驗(yàn)環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進(jìn)行。為獲得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最好在取樣 2h 內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樣本存放時間越長，細(xì)胞分離效果越差。樣本放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。

 

• 本實(shí)驗(yàn)最好不使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應(yīng)使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因?yàn)殪o電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細(xì)胞分離效果。

 

• 分離液用量大于骨髓單細(xì)胞懸液樣本量時，分離效果更佳。

 

• 如實(shí)驗(yàn)后細(xì)胞得率或活性過低，請聯(lián)系技術(shù)以尋求支持幫助.

 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細(xì)菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
 
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
 
【參考值（參考范圍）】
 
本實(shí)驗(yàn)單核細(xì)胞提取率大于 80%。
 
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例，用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。
 

		紅細(xì)胞			白細(xì)胞		血小板
				（4.0-10.0）×109
含量（個/L）		（4.0-5.5）×1012		中性粒細(xì)胞	淋巴細(xì)胞	單核細(xì)胞	（1.0-3.0）×1011
				50%-70%	20%-40%	3%-8%
【相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方案】
1.	骨髓沖洗單細(xì)胞懸液制備技術(shù)。
2.	所獲得單核細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
3.	所獲得單核細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
4.	所獲得單核細(xì)胞的鑒定方法
	A.流式細(xì)胞技術(shù)
	B.免疫組化技術(shù)
	C.原位雜交技術(shù)

 
D.PCR 技術(shù)
 
 
【可能存在的問題及解決方法】
 
1. 由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示：
 

出現(xiàn)情況	出現(xiàn)原因	建議解決方案
離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層	轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短	適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速
離心后目的細(xì)胞存在于分離液中	轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長
離心后白環(huán)層彌散	細(xì)胞密度過大	調(diào)整細(xì)胞密度
離心后白環(huán)層太淺或看不見	細(xì)胞密度過小

 

• 本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心，其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，恒定離心時間，對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。

 

• 本分離液依照國際標(biāo)準(zhǔn)，全部使用藥用級原料，性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同，可能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不完全的情況，可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。

 
注：在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時，離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g 為基數(shù)，直至達(dá)到最佳分離效果，
 
離心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min 為準(zhǔn)。