產(chǎn)品類別：血管內(nèi)皮細胞的分離
 
產(chǎn)品編號：VEHY2011H
 
產(chǎn)品名稱：馬血管內(nèi)皮細胞分離液試劑盒
 
產(chǎn)品規(guī)格：2X200ml/Kit
 
產(chǎn)品價格：￥1200.00元
本品用于分離馬血管內(nèi)皮細胞


“XXXX”動物血管內(nèi)皮細胞分離液實驗方法
 
技術(shù)文檔編號：TBD0043SOP
 
【產(chǎn)品規(guī)格】
 
2×200ml/Kit
 
【產(chǎn)品組成】
 
為方便廣大用戶使用，試劑內(nèi)容如下：
 

	名稱	產(chǎn)品編號	規(guī)格
A	分離液 1		200ml
B	分離液 2		200ml
C	試劑 F（贈品）	F2013TBD	200ml
D	樣本稀釋液（贈品）	2010C1119	200ml
E	清洗液（贈品）	2010X1118	200ml
F	說明書		1 份

 
【實驗前準備】
 
適用儀器:最大離心力可達 1200g 的水平轉(zhuǎn)子離心機
 
【檢驗方法】
 
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。
 

• 首先制備單細胞懸液，制備方法詳見“組織單細胞懸液制備技術(shù)（文檔編號：

 
TBD0004SOP）”。
 

• 取一支離心管，依次小心加入分離液 1、分離液 2（體積比為 3:1，試劑總量與細胞懸液體積比為 2：1。如細胞懸液為 2ml，則先后加入分離液 1：3ml、分離液 2：1ml。試劑總量最少不低于 4ml。），制成梯度界面，各液面分層一定要清晰。

 

• 用吸管小心吸取細胞懸液加于分離液液面上，500g，離心 25min（注：根據(jù)樣本量確定離心條件，血液樣本量越多，離心力越大，離心時間越長，具體離心條件需客戶自行摸索，以達到最佳分離效果）。

 

• 離心后，此時離心管中由上至下分為六層。第一層為稀釋液層。第二層為環(huán)狀乳白色內(nèi)皮細胞層（第一層白環(huán)及上層 50%分離液 2）。第三層為環(huán)狀乳白色單個核細胞層（下層50%分離液 2 及第二層白環(huán)）。第四層為透明分離液 1 液層。第五層為粒細胞層。第六層為紅細胞層。

• 用吸管小心吸取第二層到另一 15ml 離心管中，往所得離心管中加入 10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118），混勻細胞。

 

• 250g，離心 10min。

 

• 棄上清。

 

• 用吸管以 5-10ml 清洗液（產(chǎn)品編號：2010X1118）重懸所得細胞。

 

• 250g，離心 10min。

 

• 重復 7、8、9，棄上清后以 0.5ml 后續(xù)實驗所需相應液體重懸細胞。

 
分離圖例：
 
 
 
【差異貼壁法純化細胞】
 
（1）用內(nèi)皮細胞無血清培養(yǎng)基（產(chǎn)品編號：TBD20180011）或內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)基（產(chǎn)
 
品編號：TBD20180051）以 1.5-3×10⁶ 個/ml 的密度重懸細胞，將細胞鋪于一次性細胞
 
板或細胞瓶中，放于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中進行貼壁培養(yǎng)。
 
（2）2-4 小時內(nèi)貼壁的為巨噬細胞前體（俗稱為單核細胞）。
 
（3）10-24 小時內(nèi)貼壁的單個核細胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細胞、干細胞。
 
（4）不貼壁的為淋巴細胞。
 
注：
 

• 無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分，為得到更佳培養(yǎng)效果可添加 10%自體血漿或2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。

 

• 完全培養(yǎng)基中含 2-20%胎牛血清（血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細胞而定）。

 

• 由于每種細胞的貼壁時間存在差異可將所得細胞分開已達簡單的純化目的，此法成本相對較低。如需獲得高純度目的細胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰

性分選。
 
【注意事項】
 

• 全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2℃的條件下進行。為獲得最佳的實驗結(jié)果，最好在取樣 2h 內(nèi)進行實驗，樣品存放時間越長，細胞分離效果越差。樣品放置超過 6h 后分離效果更差甚至不能達到分離目的。

 

• 本實驗最好不要使用高聚合材質(zhì)（如聚苯乙烯）的塑料制品，應使用無靜電、低靜電離心管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品，因為靜電作用將導致細胞貼壁、堿處理的玻璃表面會變成毛面，影響細胞分離效果。

 

• 吸取過多的目的細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數(shù)量增加。

 

• 如所實驗后細胞得率或活性過低，請聯(lián)系技術(shù)支持以尋求幫助。

 
【儲存條件及有效期】
 
常溫保存，有效期 2 年。本品易感染細菌，需無菌條件操作。無菌條件下操作，啟
 
封后置常溫保存。如 4℃保存，本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。
 
【參考值（參考范圍）】
 
本實驗內(nèi)皮細胞提取率大于 80%。
 
下表為成年人外周血中各種細胞的數(shù)量及比例，用戶可適當進行參考。
 

	紅細胞		白細胞		血小板
		（4.0-10.0）×109
含量（個/L）	（4.0-5.5）×1012	中性粒細胞	淋巴細胞	單核細胞	（1.0-3.0）×1011
		50%-70%	20%-40%	3%-8%

 
【可能存在的問題及解決方法】
 

• 由于血液粘度或其他個體差異，可能會造成以下兩種情況：a：離心后細胞在上層的血漿層中或稀釋液層中，是由于轉(zhuǎn)速過小造成的，用戶可適當增加轉(zhuǎn)速，每次增加以 50-100r/min 為基準，直至達到最佳分離效果。

b：離心后細胞在分離液中，是由于轉(zhuǎn)速過大造成的，用戶可適當降低轉(zhuǎn)速，每次降低以 50-100r/min 為基準，直至達到最佳分離效果。
 
本分離液的密度與氣壓、溫度，以及樣本差異，客戶需要對離心條件進行調(diào)整，建議調(diào)整時，恒定離心時間，調(diào)整轉(zhuǎn)速來達到最佳分離效果。